来源于人多能干细胞（hiPSC）的人脑类器官与原代组织具有显著的结构和分子相似性，已成为体外研究的良好模型。不过，由于脑类器官体积大、光学致密、发育周期长、无菌条件难以维持等特性，传统的成像技术往往无法满足对其发育复杂过程长期、动态的观察需求。这对理解早期脑类器官的形态动力学，以及细胞外微环境在人脑发育早期阶段中的作用带来了严重挑战。

2025年6月18日，瑞士苏黎世联邦理工学院团队在顶刊Nature发表论文“Morphodynamics of human early brain organoid development”，首次系统性建立了人脑类器官形成的多尺度形态动力学视角，突破了类器官长期活体动态成像的技术瓶颈。研究团队首先优化了多重荧光标记的脑类器官培养方案，随后通过配套的光片显微系统及算法成功对类器官发育两周内的组织形态动力学、细胞行为及其与细胞外基质(ECM) 的相互作用进行了深入研究。

结果发现，外源性ECM（如基质胶）的添加可促进类器官的形态发生、细胞极化、区域化和功能成熟，显著改善类器官的发育过程，驱动类器官向前脑及端脑分化。该调控过程依赖于对YAP1活性及WNT信号通路的抑制。总之，本文为未来脑类器官的优化以及脑部疾病的探索提供了重要指引。

研究团队首先构建了一组具有遗传荧光标记的hiPSC，每种细胞系表达一种内源性标记蛋白，以示踪质膜、肌动蛋白细胞骨架、微管、细胞核及核膜。五种标记系与未标记的亲本以2:100（标记:1、未标记）的比例组合并培养为脑类器官，以方便后续更清晰地分辨和追踪单个细胞或细胞核，从而在三维空间中同时观察多个亚细胞结构（如细胞膜、细胞骨架等）的变化动态。

接下来，研究团队调整了脑类器官培养方案，减少了使用的iPSC细胞数量以限制类器官的初始尺寸；并在第4天即将类器官转移到神经诱导培养基中，以将分化时间提前。这种较小的初始尺寸和早期诱导的结合，使得类器官在发育过程中能够更早地形成扩张的腔室和神经上皮结构，从而更好地模拟人类大脑发育的早期阶段。

从培养第4天开始，研究人员通过光片显微镜对新获得的内源标记的脑类器官进行了188小时的连续成像，时间分辨率为30分钟，观察到类器官从球形胚状体逐渐转变为具有扩张腔室的神经上皮结构的过程。

在另一组针对16个类器官的24小时成像实验中，观察结果共揭示了类器官发育的三个阶段，即早期快速组织和腔室生长阶段、组织稳定阶段（腔室融合事件）以及神经上皮成熟阶段。

以上对脑类器官发育的准确捕捉证明，新型类器官培养方案和长期成像技术的结合可用于探索器官发育的多个阶段，方便了对神经上皮形成和大脑区域化的深入研究。

图：荧光标记脑类器官的长期活体成像

脑类器官中腔室的形成模拟了人类胚胎中神经管的管腔，是神经上皮细胞极性正确建立的标志，有助于神经祖细胞有序排列，对大脑皮层的分层结构模拟非常关键。因此，腔室的形态、数量和组织性常被用作评估脑类器官发育成熟度的指标之一。适度的腔室数量和良好的极性结构通常意味着更稳定的谱系分化和更高的可重复性。

本研究发现，添加基质胶的类器官体积更大，形成的腔室更长、更不规则，且在第5天即达到了腔室数量的峰值。相比之下，未添加外源性基质的类器官则形成更多的腔室，但体积较小，且腔室数量直到第7.8天才达到峰值。

进一步的实验表明，ECM的组成和机械特性对腔室形态动力学有显著影响。实验中，类器官在含有层粘连蛋白（Laminin-111）的PEG基质中表现出更大的腔室体积和更长的腔室主轴，与基质胶条件下的类器官相似。而含有胶原蛋白肽（GFOGER）的PEG基质则导致腔室数量减少。

以上结果证实，外源添加的基质胶在脑类器官中诱导了腔室形成、扩张和融合，对人脑类器官的组织规模形态发生具有促进意义。

图：外源性ECM影响脑类器官的形态发生

接下来，研究人员开发了一套基于空间嵌入的实例分割算法，对脑类器官中五种不同的荧光标记进行了单细胞水平的形态分析。

结果发现，随着脑类器官的发育，细胞形态从圆形逐渐转变为长形，核的体积也随之减小。时间序列分析显示，细胞形态的变化具有明显的时空动态，如细胞的主轴长度随时间增加，而核的体积则逐渐减小。这些变化在添加基质胶的条件下更为显著。

此外，基质胶的添加还诱导了更高的细胞极化程度，并降低了细胞形态的异质性，这可能归因于ECM在类器官外周区域蛋白丰度的提升和稳定基底膜的形成。总而言之，以上特性有助于均质的神经外胚层和神经上皮的形成，从而提供了更接近真实大脑结构和功能的类器官模型。

图：荧光标记的细胞和细胞核形态变化

类器官的区域化指在类器官发育过程中，不同的细胞群体逐渐分化并形成具有特定功能和身份的区域，是其模拟真实大脑发育的重要特征之一。研究团队利用多重免疫组化技术（4i）对类器官进行了多轮蛋白质标记和成像，结果发现，基质胶的添加显著影响了类器官的区域化。

具体而言，第15天，添加基质胶的类器官主要形成前脑祖细胞，显示出被前脑祖细胞包围的大腔室。而未添加外源性基质的类器官则形成更多的非前脑祖细胞和神经嵴细胞。到第21天，基质胶类器官外围主要由端脑组成，而对照组则由见脑细胞和神经嵴细胞组成。scRNA-seq分析同样证明，基质胶可调控类器官的不同分化路径和功能。

图：多重免疫组化技术（4i）揭示了类器官发育过程中空间区域的出现。

对发育第13天类器官的单细胞转录组分析揭示，WNT-β-catenin 信号通路在无基质胶的类器官中高度上调（相关上调基因包括WLS、RSPO3和GPC3等）。此前，WLS已被确定为人脑类器官中非端脑命运的最早标志之一。研究团队还观察到，在无基质胶条件下上调的WLS以及其他WNT相关基因在人类原代发育脑的非端脑细胞中高度表达。因此，研究团队假设基质胶通过调节WNT信号通路来调节脑类器官的背腹向和喙尾向模式。

近来已经有报道称，YAP1作为一种参与感知组织机械特性的机械传感器，可以上调心肌细胞中包括WLS在内的WNT通路基因，并介导WNT和Hippo信号通路间的串扰。本文中，发育两周后，研究人员在无基质胶的类器官中观察到了更高的WLS水平，YAP1表达也有同步上调。研究团队随后通过CUT&Tag在早期发育的脑类器官中定位了YAP1与基因组的结合，观察到无基质胶类器官中，YAP1作为WNT信号通路的关键调节因子，通过上调WLS（WNT配体分泌介质）的表达，促进了类器官的尾部化，形成更多的非前脑区域。与此一致的是，用 YAP1 激活剂处理的基质胶中生长的类器官表现出无法扩张和维持腔室，导致类器官形态发生改变。

图：YAP1 机械转导介导的 WLS 激活

本研究通过开发长期活体成像技术和多荧光标记策略，为类器官发育的动态研究提供了新的工具。并且使用新建立的平台，揭示了ECM在类器官形态发生和区域化中的关键作用，证明可以通过调节ECM的组成和机械特性，更精确地控制类器官的发育方向，使其更接近真实的人类大脑组织。这对于研究神经发育疾病、药物筛选和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。